南京5357cc拉斯维加斯首页入口生物：显著降低蛋白质样品的复杂度

阅读次数：16069 发布时间：2016/5/28 22:38:11

蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。由于基因表达往往是通过基因的转录、表达产生一个蛋白质前体，在此基础上再进行加工、修饰，才成为一个具有生物活性的蛋白质，所以同样的一个基因在不同条件、不同时间和空间可能不只有一种相应的蛋白质，可能会有几种，甚至几十种对应的蛋白质存在。正是蛋白质样品的这种高复杂度和不同蛋白浓度的高差异性，使蛋白质组学研究面临着挑战。

所以，如果能有一种技术，显著降低蛋白质样品的复杂程度，将大大提高蛋白质组学研究的效率。而Agilent 3100 OFFGEL等电聚焦分离仪正是这样一款，它能显著降低蛋白质样品复杂度，提高后续分析的灵敏度及分辨率。

3100 OFFGEL的技术原理

基于等电点在液相环境下分级分离蛋白质或多肽，即蛋白或多肽样品置于IPG（固化PH梯度）胶条上方间隔中（内含缓冲液），在电场作用下，样品在IPG胶条中迁移，逐步等电分离，*终样品保留在上层缓冲液中，可方便的取样进行下一步实验。

如图，实验之前，蛋白或多肽样品直接加到缓冲液中，免去了样品溶入IPG胶条的步骤；
实验结束后，样品保留在溶液中，避免了割胶回收的步骤。

Agilent 3100 OFFGEL的主要作用

在蛋白质组学实验中，Agilent 3100 OFFGEL主要用于对蛋白样品进行基于等电点的预分离，显著降低蛋白样品的复杂度，提高下游检测的灵敏度。蛋白组学研究的三大支撑技术：双向电泳、质谱和计算机图像分析与大规模数据处理技术，后两种技术都可以和Agilent 3100 OFFGEL配合使用，对样品实现预分离。根据所用试剂盒可达到pH 0.1–0.6的分辨率，而且溶液中的分离成分回收，方便了LC/MS分析。

3100 OFFGEL如何配合LC-MS/MS使用？

一般的LC/MS工作流程是:生物样品（细胞、血浆、血清、体液等）裂解——蛋白提取——胰酶消化成肽段（根据需要进行冻干、用甲酸重溶解、纯化等步骤）——3100 OFFGEL（约20h）——液相回收多肽——脱盐——冻干——用甲酸重溶解——上LC-MS——获得的肽段与数据库对比，鉴定肽段（注：1. 蛋白提取后，可以不用胰酶消化，直接上样，相对肽段样品来说回收率低，灵敏度也低；2. 在冻干前是否需要脱盐取决于LC-MS是否有在线脱盐功能）。

3100 OFFGEL的优势有哪些？

1、3100 OFFGEL 可以显著提高MS分析的蛋白检出率

使用OFFGEL分离后，质谱检测出蛋白数是先前的4倍

2、3100 OFFGEL 的蛋白或多肽分离结果具有极好的重复性

同一样品用OFFGEL进行3次分离，跑SDS-Page验证OFFGEL分离的重现性

3、3100 OFFGEL的分离结果具有极高的分辨率

3100 OFFGEL的技术特点

• 基于PI的游离胶预分馏，根据所用试剂盒可达到pH 0.1–0.6的分辨率
• 溶液中的分离成分回收，方便了LC/MS分析
• 两个电源设置允许同时分离两组浓度相差很大的样品
• 一次可同时分馏多达16个样品
• OFFGEL（游离胶）或INGEL（传统IEF）两种模式可选
• 宽范围上样量：50 μg ~ 5 mg
• 高回收率：蛋白＞70%，多肽＞80%
• 开放耗材：多种 IPG-strips可供选择
• 可进行实时“诊断”：通过观察电流变化判断样本的分离情况
• 简便、重现性好、容易使用
• 整合性：可以兼容多个系统完成一系列工作，例如整合MARS, LC/MS, mRP以及生物分析仪等

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