二步法：EnVision System
EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即 EnVision）直接放大信号40-50倍 ，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育 。特点 ：敏感 、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。
EnVision工作程序：
1） 脱蜡、水化组织切片 。
2） 预处理组织切片（据一抗具体说明而定）
3） 蒸馏水漂洗，置于TBS中。
4） 阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）
5） 蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟
6） 一抗孵育10-30分钟
7） TBS漂洗10分钟
8） EnVisionTM孵育10-30分钟
9） TBS漂洗10分钟
10) 色源底物溶液孵育10分钟
11) 蒸馏水漂洗
12) 复染及封片
免疫染色方法
The basic principles of ICC
• 抗原抗体反应
• 标记化学反应
• 呈色化学反应
要求
待检标本形态结构
和抗原性保存良好,
抗原不从原位扩散
或丢失
Specimen preparation
取材新鲜 ，固定及时，形态保存完好 ，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏
• Fixation
• Sample Type
Cryostat (frozen) sections
Paraffin Sections
Antigen Retrievals Techniques
• Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .
Antibody Staining
• Primary antibody may be directly labeled
• labeled secondary antibody or more complex detection system.
• secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source
减少或消除非特异性染色的方法
• *常见原因 蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上
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