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阅读次数：17315 发布时间：2017/11/14 15:12:04
髓过氧化物酶(MPO)测试盒说明书
一．试剂组成与配制：（100T/48样）
试剂一：缓冲贮备液35ml X 1瓶，4℃保存6个月
缓冲应用液的配制： 贮备液 ：双蒸水=1:9 ，按需要量配制 ，4℃保存1个月。
试剂二： 粉剂X2支 ，4℃保存6个月。临用时每支加缓冲应用液60ml溶解，可以37℃加热溶解，4℃保存2周 。
【注】若您所需测的是组织样本 ，并且除髓过氧化物酶之外 ，还需测其他项目时 ，此时每支试剂二粉剂需配成浓缩一倍的溶液 ，即每支试剂二粉剂加到缓冲应用液30ml中 。
试剂三： 粉剂 X3支，溶剂6mlX3支，4℃保存6个月 。用时1支粉剂倒入1支溶剂中溶解 ，提前一天配制，充分溶解后4℃保存2周。
试剂四：溶液24mlX1瓶 ，天冷时会凝固。用前放入37℃以上的水中摇晃使其溶解至透明后方可应用 ，室温保存6个月 。
试剂五：粉剂X2支 ，4℃保存6个月。
试剂六：溶液0.5mlX1支，4℃保存6个月。
显色剂的配制：临用时将试剂五粉剂1支加到100ml缓冲应用液中 ，充分摇匀，待粉剂完全溶解后再加入试剂六0.1ml，充分混匀，配制好的显色剂4℃避光保存 。
试剂七：溶液6ml X1支 ，4℃保存6个月 。
二．组织样本的MPO测定
（一） 、样本前处理
1.准确称取组织重量，以配制好的试剂二溶液为匀浆介质，按重量体积比为1:19加匀浆介质制备成5%的组织匀浆，不需要进行离心。
【注】 ：若您除做髓过氧化物酶之外 ，还需要测其他指标时，则组织匀浆制备要按下面方法：
1.试剂二配制时要浓缩一倍，即每支试剂二粉剂加到30ml缓冲应用液中；
2.先用生理盐水为匀浆介质按实验方法学制成浓缩一倍的匀浆，即10%匀浆（脑组织制备成20%匀浆），不要离心，取出部分浓缩一倍匀浆按1:1比例加入浓缩一倍的试剂二溶液 ，混匀后再进行测定 。
2.取5%组织匀浆0.9ml加3号试剂0.1ml ，（如果组织匀浆量不够，可以按9:1的比例减少组织匀浆及3号试剂的用量），充分混匀后37℃水浴15分钟，取出后待测。
（二）、操作表 ：
|
| 对照管 | 测定管 |
| 双蒸水（ml） | 3 |
|
| 样本（ml） | 0.2 | 0.2 |
| 试剂四（ml） | 0.2 | 0.2 |
| 显色剂（ml） |
| 3 |
| 混匀，37℃水浴30分钟 | ||
| 试剂七（ml） | 0.05 | 0.05 |
混匀，60℃水浴10分钟 ，取出后立即在460nm处，1cm光径，双蒸水调零 ，测各管吸光度值。
注1： 天冷时，反应液会出现凝固状态，吸光度上升，您可以用25 - 37℃水浴箱或取一个盛25 - 37℃热水的烧杯放在比色机旁边，将各待测管一次放入水浴箱或烧杯中1 - 2 分钟，待凝固消失后即可进行比色 。
注2：混匀时 ，用漩涡混匀器，使液体上下充分混匀（一定要使*下面液体也能旋转到上面 ，建议不要用尖底的管子做，尤其不可用1.5ml的EP管 ，因为这样非常难混匀）
（三）、计算：
1.酶活力单位定义 ：每克组织湿片在37℃的反应体系中 ，H2O2被分解1umol为1个酶活力单位。
2.计算公式：MPO活力=
3.计算举例：
例一：取5%的小鼠心肌匀浆0.2ml按上述步骤进行检测 ，测得对照管吸光度为0.030，测定管吸光度为0.164 ，则计算如下：
例二：取5%的大鼠肝匀浆0.2ml按上述步骤进行检测 ，测得对照管吸光度为0.028，测定管吸光度为0.183 ，则计算如下：
例三 ：取10%的大鼠肝匀浆0.2ml按上述步骤进行检测 ，测得对照管吸光度为0.002 ，测定管吸光度为0.012，则计算如下：
【注】*11.3为斜率的倒数
** 取样中所含组织湿片的量（克）
*** 0.05为5%的组织匀浆，即5克组织/100ml组织匀浆 。
**** 0.2为取样量0.2ml。
三、血清（浆）样本中MPO测定
（一）、血清（浆）样本前处理 ：
1、 取血清（浆）与试剂二按1:1比例稀释，充分混匀。
2.取上面的混合液0.9ml加3号试剂0.1ml ，（如果混合液量不够，可以按9:1的比例减少混合液及3号试剂的用量），充分混匀后37℃水浴15分钟 。
（二） 、操作表 ：
|
| 试剂空白（可以不做） | 对照管 | 测定管 |
| 双蒸水（ml） | 0.2 | 3 |
|
| 样本（ml） |
| 0.2 | 0.2 |
| 试剂四（ml） | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 显色剂（ml） | 3 |
| 3 |
| 混匀 ，37℃水浴30分钟 | |||
| 试剂七（ml） | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
混匀，60℃水浴10分钟 ，取出后立即在460nm处 ，1cm光径 ，双蒸水调零，测各管吸光度值。
注1:天冷时，反应液会出现凝固状态，吸光度上升，您可以用25~37℃的水浴箱或取一根盛25~37℃热水的烧杯放在比色机旁边，将各代测管一次放入水浴箱或烧杯中1~2分钟 ，待凝固消失后即可进行比色。
注2：混匀时 ，用漩涡混匀器，是液体上下充分混匀（一定要使*下面液体也能旋转到上面，建议不要用尖底的管子做，尤其不可用1.5ml的EP管，因为这样非常难混匀）
（三）、计算：
1、酶活力单位定义 ：每升血清（浆）在37℃的反应体系中H2O2被分解1umol为1个酶活力单位。
2、计算公式：
3 、计算举例：
取0.45ml的血清加0.45ml的试剂二充分混匀，再加0.1ml的试剂三，再充分混匀 ，37℃水浴15分钟后 ，取0.2ml做检测，测得测定管OD值0.053，对照OD值0.013，则计算如下 ：
注：* 11.3为斜率的倒数
** 取样中所含血清的量（升）
*** 0.45为血清的量
**** 0.2为取样量0.2ml
四 、测定原理 ：
中性白细胞中存在有髓过氧化物酶 ，每个细胞中所含的酶的量是一定的 ，约占细胞干重的5%，该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力 ，并定量测定中性白细胞的数目。其原理如下：
MPO+H2O2→复合物 ；复合物+AH2(供氢体) →H2O+MPO+A产物
通过供氢体邻连茴香胺供氢后生产黄色化合物，在460nm处通过比色测定A产物的生成量，从而推算出MPO的活力以及H2O2减少的量和白细胞的数目 。
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