检验原理：辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG聚合物与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物 ，聚合物上的HRP催化底物H2O2与DAB（或AEC）反应，*终形成棕褐色（或红色）不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定抗原的位点。
适用：手工操作 ，机器染色
检验方法：
1、检验所需仪器、设备 ：移液器 、恒温箱 、修复仪、免疫组化笔、计时器 、孵育盒、染色架、盖玻片 、光学显微镜、洗瓶 。
2、试剂准备：DAB显色液需要在使用前配制。
3、操作程序：
a) 脱蜡和水化
石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×3次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟×3次；去除多余的液体后 ，置于95%乙醇中，浸泡3分钟×2次；去除多余的液体后，置于75%乙醇中 ，浸泡3分钟×2次 ；蒸馏水冲洗1分钟 ，置于PBS缓冲液中。
b) 抗原修复，参见一抗说明书。
c) 阻断内源性过氧化物酶
加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次 。
d) 滴加一抗
根据组织大小 ，滴加100μL或适量的一抗 ，37℃孵育60分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。
e) 滴加酶标羊抗兔IgG聚合物
滴加100μL或适量的酶标羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次 。
f) 显色
加入适量新鲜配制的DAB或AEC显色液，室温孵育5～8分钟。
g) 复染
自来水冲洗，苏木素染色液孵育20秒；分化、冲洗返蓝。
h) 脱水 、透明、封片
i) 阅片 。
4 、结果判定 ，染色结果须由有资质的病理医生对染色后的组织片在光学显微镜下观察并进行判读。
检验结果的解释：
1、抗原修复、孵育时间、温度的修改或使用其他方法均有可能得出错误结果 。
2、在每一次染色过程中 ，必须有空白对照和阴性对照实验同时进行。
3、如果阳性组织对照不能显示适当的阳性染色，应判定该批次样本的检测结果无效。
4 、若酶标羊抗兔IgG聚合物孵育温度过高或孵育时间过长，可能导致染色过强及背景染色。
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检验方法的局限性 ：
1、免疫组织化学染色是一种需通过多个操作步骤完成的检测过程 。在组织前期处理和实验过程中的不规范操作 ，有可能影响
实验结果 。
2、专业的操作人员 、经过认证的实验室和标准化的实验流程，可以减少各种外界因素造成的操作偏差。
3 、红细胞和细胞色素 C可能会造成假阳性结果。
4、阴性结果表示未检出抗原，不一定表示样本中无该抗原存在 。待测抗原编码基因变异、抗原低表达或抗原修复不当等，都会造成抗原无法检出 。
5、本试剂仅对10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋的组织进行了验证 ，不作其他用途。
产品性能指标：
1 、装量 ：试剂盒各组份的溶液装量应不少于标示装量 。
2、符合性 ：取符合性组织片（包括阳性组织对照和阴性组织对照），经相应的免疫组化实验后 ，应阳性着色定位准确，且无背景染色 ；同时 ，空白对照和阴性对照染色结果为阴性。
3、批内重复性：取同一批次的试剂盒，检测组织片3片，染色强度和定位无明显差异。
注意事项：
1 、本染色液仅用于免疫组化，不做其他用途。
2、本染色液仅限专业人员使用 。应用适当的防护措施，以避免试剂同皮肤和眼睛接触 。
3、染色液中的DAB底物液为致癌物质 ，操作中应采用合理的防护措施。
4、超过有效期的试剂活性可能降低 ，因此不得使用过期的试剂盒。
5、脱蜡不彻底 ，容易影响染色效果，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开 。
6 、为防止可能出现的假阳性、假阴性结果 ，在实验过程中需设置阳性与阴性对照。
7、实验中滴加试剂时，过多的PBS缓冲液会导致试剂被稀释，将引起染色强度变弱，因此，滴加试剂前应除去多余的缓冲液。
8 、使用中所产生的各种废弃物都应按《医疗废物管理条例》处理。
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